Термодинамические расчеты


Термодинамические расчеты показали, что этапом, лимитирующим скорость этой реакции, является восстановление кислорода с образованием комплекса ЕО, тогда как регенерация Е из ЕО протекает сравнительно быстро. Дальнейшие исследования продемонстрировали, что бензойная кислота выступает как конкурентный ингибитор этой тирозиназы по отношению к о-дифенолу и как смешанный — по отношению к О2. С цианидом наблюдалась обратная картина [Gutteridge Robb, 1975].

Позднее Лерх [Lerch, 1976а], усомнившись в существовании столь принципиального различия между тирозиназой N.crassa и тирозиназой Agaricus bispora, каким является содержание одного атома меди в активной единице тирозиназы у первого организма вместо двух атомов у другого (присутствие которых хорошо и неоднократно документировалось), предпринял новые исследования на препаратах тирозиназы N.crassa штамма FGSC No320. Фермент был очищен солевым фракционированием и комбинированной ионообменной и оксиапатитовой хроматографией и показывал гомогенность по критериям дискэлектрофореза и изоэлектрофокусирования. Использование различных методов определения молекулярной массы показало, что она может быть принята за 42 000. Содержание меди, определенное (так же как и в ранее рассмотренной работе) 2,2’-бихинолиновым методом, свидетельствовало о присутствии 2 грамм — атомов меди на единицу ферментного белка с указанной молекулярной массой.

Эти данные согласовывались с полученными на ферменте Agaricus bispora и приводили к выводу о существовании двух ионов меди в активном центре тирозиназы N. crassa. Далее это подтвердилось результатами изучения реакции фермента с Н2 O2, В присутствии воздуха рассматриваемый фермент, так же как и фермент, изученный ранее [Gutteridge, Robb, 1975], показал стехиометрическую реакцию с Н2 O2 с выходом оксигенированного комплекса, характеризующегося сильным погло- щением при 345 нм и более слабым — при 600 нм, которое исчезало при удалении O2. Спектры нативного и Н2 O2 — обработанного фермента были близки к свойствам «грибной» окиситирозиназы. Расчет коэффициентов экстинкции и стехиометрия реакции свидетельствовали о необходи-мости 1 молекулы Н2 O2 для взаимодействия с 2 атомами меди.