Сообщения о подобных попытках принадлежат японским авторам. Мотода с сотрудниками [Motoda et al., 1970, 1971; Motoda,, 1978, 1979a, b] осуществили поиск грибов-продуктов ферментов, осуществляющих высокоактивное окисление катехинов чайного листа. Было проверено свыше 100 штаммов, в том числе 58 штаммов Aspergillus, 13 — Rhozopus, 38 — фитопатогенных грибов, выделенных из больных растений, а также несколько форм из воздуха. Большинство отобранных по указанному критерию штаммов (18 грибов), за двумя исключениями, принадлежали к группе фитопатогенных организмов. Два штамма — исключения были выделены из воздуха.
В соответствии с тестами, определяющими видовую принадлежность, они были идентифицированы как Alternaria tenuis А-2 и Cladosporium cladosporioides. Поскольку самая высокая активность была выявлена у Alternaria tenuis А-2, все дальнейшие исследования полифенолоксидазы, окисляющей катохины в теофлавины, проводились уже с этим единственным организмом.
Фермент, как было показано, локализуется в основном внутриклеточно, а внеклеточная активность, если и определялась, то была значительно более низкой. Было замечено, что синтез этого фермента белка заметно стимулировался экстрактом зеленого чая, дрожжевым экстрактом, а из индивидуальных веществ — d-катехином (10-14 М). При добавлении 10-14 М пирокатехина к среде рост культуры задерживался, а образование фермента подавлялось. Активная кислотность среды сказывалась на синтезе фермента довольно заметно, pH-оптимум лежал в кислой зоне (pH 4,5-5). Максимальный «выход» фермента получался при дополнении среды ионами Сu2+ и Мo6+ (в сочетании). Ионы Мо6+, взятые в отдельности, вызывали только слабую реакцию, тогда как эффект Сu2+ и в этом случае был достаточно выражен. Наилучшими источниками углерода были признаны глюкоза, сахароза и ксилоза, азота — соли аммония.
На основании полученных данных авторами была предложена среда, наиболее подходящая для рентабельного культивирования штамма-продудента. Ее состав: глюкозы — 50 г, (NH4)2 SO4 — 5 г, MgSO4•7H2 O — 2,5 г, КН2 РO4 — 10 г, CuSO4•5H2 O — 39,3 мг, (NH4)6 Mo7 O24•4 Н2 O — 9,2 мг, экстракта зеленого чая — 4% и водопроводной воды — 900 мл. Наблюдения за динамикой накопления фермента в клетках Alternaria tenuis А-2 в 5-литровом ферментере показали, что его продукция выходит на максимум через 21 час после инокуляции (культивирование при 30°), а затем быстро падает. Указанное время соответствовало концу экспоненциальной фазы роста культуры. Характеристика фермента дана в соответствующем разделе.
Далее было показано образование летучих альдегидов, придающих специфический аромат чаю и кофе, из аминокислот при участии хинонов — продуктов фенолоксидазной реакции, осуществляемой ферментом Aiternaria tenuis А-2 (Motoda, 1979с).
В Японии же используется другой гриб с высокой полифенолоксидазной активностью — As- pergillus oryzae АТСС 22788 для приготовления национального рисового соуса койи, в связи с чем изучался и сам фермент, и продукты его реакции (Ohba et al., 1971; Bizen et al., 1972).