Тогда же впервые была высказана мысль о том, что разница в термостабильности энзимов базируется на их структурных особенностях, что подтверждалось следующими наблюдениями: частичная очистка энзимов не только не снимала разницы в термостабильности, но даже усиливала ее; кинетика инактивации подчинялась ходу реакций первого порядка; скорость термальной инактивации смеси двух энзимов соответствовала сумме индивидуальных скоростей (Horowitz, Fling, 1953). Позднее было сообщено о том, что эннзмы различаются и по электрофоретической подвижности (Horowitz, Fling, 1957).

Однако определение некоторых функциональных свойств этих энзимов — субстратной специфичности, Кs и числа оборотов — показало полное сходство энзимов по этим характеристикам (Horowitz, Fling, 1956а). Детально сравнение высокоочищенных препаратов TS и TL (Sussman, 1961) также не выявило различия между ними по отношению к 30 субстратам (моно-, ди- и тризамещенным фенолам), т. е. по субстратной специфичности. Константы Михаэлиса — Ментен для обеих форм энзима при их действии на тирозин и ДОФА также были идентичными, как и значение pH-оптимума реакции и ответ на воздействие различных ингибиторов. Таким образом, эти наблюдения полностью подтвердили ранее сделанное заключение о функциональном подобии ТS и TL, Разница между энзимами касалась их вторичной и третичной структуры, что было установлено в экспериментах с агентами, вызывающими «раскручивание» белковой молекулы мочевиной н формальдегидом. Эти соединения инактивировали термолабильную тирозиназу больше, чем термостабильную. Эта разница также может быть объяснена только структурными модификациями, которые состоят, по-видимому, в изменении числа или типов связей, которые определяют характер сворачивания (скручивания) белковой молекулы, или того и другого одновременно. Сопоставление аминокислотного состава TS и TL показало их практически полную идентичность (Horowitz et at., 1961) за исключением того момента, что S-форма содержит несколько больше серина, чем L-форма, хотя обе они богаты этой аминокислотой (Fling et at., 1963).

Несколько позднее были найдены две новые структурные формы энзима, отличные друг от друга и от ранее описанных S- и L- форм. Они были выделены из штаммов Puerto-Rico-15 и Singa- рого- 2, почему и получили индексы PR-15 и Sing-2. Это исследование показало большую вероятность существования в природе многих форм тирозиназ, которые, по-видимому, будут обнаруживаться по мере введения в обследование природных штаммов новых тестхарактеристик в дополнение к термостабильности и электрофоретической подвижности (Horowitz et al„ 1961b).