Темное вещество содержится, в основном, в недиализующейся фракции культуральной жидкости. Оно имеет типичные для гуминовых соединений свойства— черный цвет, коллоидный характер, способность растворяться в щелочах и осаждаться из них под действием кислот и др. (Hardisson, Rober-Gero, 1966). ( Эти «особенности» присущи и меланинам). Его разделение на колонке с ионообменными смолами позволило получить три фракции, идентифицированные как фульвовая, гиматомелановая и гуминовая кислоты. Аналогичные фракции были получены из гуминовых экстрактов трех различных почв, взятых для сравнения с микробным веществом в целях его идентификации. Сходство молекулярных весов соответствующих фракций (Rober-Gero et al., 1966), одинаковые спектры поглощения в УФ и видимой областях и чрезвычайно похожие ИК-спектры (Hardisson, Rober-Gero, 1966) также свидетельствуют о близости «парагуминового» пигмента Az. chroococcum к гуминовым веществам почвы. Следует заметить, что количество общего азота в нем очень мало (0,03 и 0,34% в разных фракциях), тогда как в гуминовых веществах азота значительно больше (0,10— 0,19% и 1,90—2,24% в соответствующих фракциях).

Независимо от французских исследователей, изучением этих веществ занимался также Новогрудский (1959). При культивировании азотобактера на агаризованной минеральной среде с бензоатом (1%) он также получал темное окрашивание среды. Вещества, извлекающиеся из агара 0,1 н. NaOH, могли быть разделены на две фракции: осаждающуюся из щелочного раствора кислотами (I) и неосаждающуюся (II).Во фракцию I переходила большая часть азота щелочной вытяжки и соотношение С:N в ней составляло 18,7, т. е. близкое к величинам, характерным для гуминовых кислот. Интересно, что в опытах с жидкой питательной средой (при сохранении всех условий культивирования), образующиеся темноокрашенные продукты состояли исключительно из фракции II. Аналогичная картина наблюдалась и при выращивании азотобактера на твердой среде, но с 2% бензоата натрия (при несколько угнетенном росте). Новогрудский предполагает, что это явление объясняется тем, что гуминоподобные вещества фракции I, вероятно, образуются из веществ фракции II в условиях хорошо обеспеченного аэробиоза (на твердых средах) и только при интенсивном развитии микроорганизма. При спектроскопическом сравнении темноокрашенных азотсодержащих продуктов из культуры азотобактера со щелочными растворами почвенной гуминовой кислоты были получены очень сходные кривые. По мнению Новогрудского, это указывает, если не на принадлежность микробного продукта к истинным гуминовым веществам, то на большую близость к ним. Он полагает, что для их образования необходимо наличие, с одной стороны, безазотистого циклического соединения, а с другой — азотсодержащих веществ с функциями протеинов или аминокислот. В чистых культурах азотобактера необходимость в первом веществе удовлетворяется вносимым извне бензоатом, азотистая же часть гуминовых продуктов синтезируется организмом из азота атмосферы.